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大曝光!細胞消化的三個關(guān)鍵點

更新時間:2022-11-14  |  點擊率:719

細胞消化是細胞培養(yǎng)過程中不可少的環(huán)節(jié)之一。細胞消化操作不當,容易改變細胞狀態(tài),引起細胞實驗產(chǎn)生不必要的誤差,進而影響實驗的重復性。

因此,正確合理的細胞消化操作,至關(guān)重要。

細胞消化小技巧

細胞潤洗次數(shù)

絕大部分細胞

用胰酶潤洗

一次即可

胰酶是一種蛋白酶,酶切位點是肽鏈的Lys或Arg兩個殘基的羧基端肽鏈,通過在特定位置上降解蛋白,使細胞膜上與培養(yǎng)皿壁結(jié)合處蛋白降解,從而使兩者分離。這時,細胞由于自身內(nèi)部細胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力可成為球形。

由于在細胞培養(yǎng)中,胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散。胰酶作用時間過長、作用次數(shù)過多,都容易破壞細胞表面結(jié)構(gòu)。

在吸去培養(yǎng)基后,用37℃預(yù)熱過的PBS潤洗細胞表面1-2次,隨后加入適量胰酶,以能夠平鋪在器皿底部一層,略蓋過細胞為原則,且潤洗一次即可??煞湃?7℃培養(yǎng)箱中孵育1-2分鐘。

何時終止消化

貼壁細胞層

呈流沙狀可移動

即可終止消化

有不少細胞培養(yǎng)人員,喜歡把全部細胞,消化成間隔分布很離散的單個圓形的細胞,但實際上,此時的細胞已經(jīng)處于“消化過度"的狀態(tài)了。

因此,肉眼觀察下,50%左右細胞呈現(xiàn)流沙狀,或鏡下觀察細胞質(zhì)回縮,細胞之間不再連接成片,即可加入胰酶2-3倍體積的含血清培養(yǎng)基,終止消化。

血清可以終止胰酶對細胞的消化,也為細胞提供*營養(yǎng)。選擇一款優(yōu)質(zhì)的胎牛血清,為細胞實驗提供保障。

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不用胰酶如何消化細胞

EDTA消化

或物理刮涂法

也可使細胞脫壁

只用EDTA,或者用胰酶-EDTA(Trypsin-EDTA)聯(lián)合作用,也可對細胞進行消化。其中,胰酶切割ECM的一些負責粘連和附著的蛋白,而EDTA通過螯合鈣離子,作用于整合素的活性,所以EDTA的作用更加溫和。有的人在胰酶中添加EDTA,可以對付特別難消化的細胞。

細胞刮也可以對貼壁細胞進行物理脫壁。使用時側(cè)拿培養(yǎng)器皿,用無菌細胞刮沿一個方向轉(zhuǎn)動掛,集于底部,直至刮完每一個角落即可。

另外,需要注意的是,在做細胞凋亡檢測時,不適合用含有EDTA的胰酶,可以使用物理方法對細胞進行脫壁處理。Annexin V常用于細胞凋亡檢測,是一種鈣離子依賴的蛋白,EDTA會螯合鈣離子從而影響Annexin V,進而影響結(jié)果,因此需選用不含EDTA的胰酶。

本期內(nèi)容到這里就結(jié)束了,想看更多細胞培養(yǎng)小技巧,歡迎給我們留言!


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