japanese成熟丰满熟妇,狠狠躁夜夜躁人爽碰88A,狠狠人妻久久久久久综合蜜桃,亚洲AV中文无码乱人伦在线视色

當(dāng)前位置:首頁  >  技術(shù)文章  >  支原體qPCR檢測——Venor Gem qEP的使用前準(zhǔn)備

支原體qPCR檢測——Venor Gem qEP的使用前準(zhǔn)備

更新時(shí)間:2023-09-30  |  點(diǎn)擊率:477

支原體檢測的應(yīng)用

支原體是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,常見的一類污染物。

在干細(xì)胞治療、免疫細(xì)胞治療、CAR-T、抗體藥生產(chǎn)、疫苗生產(chǎn)相關(guān)的等臨床臨床項(xiàng)目,以及細(xì)胞典藏等重大的細(xì)胞培養(yǎng)項(xiàng)目,都需要進(jìn)行支原體放行檢測,以確保產(chǎn)物沒有支原體污染。

?因此,需要建立結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡便快捷、通過《藥典》方法驗(yàn)證的檢測手段。

產(chǎn)品名稱:支原體qPCR檢測試劑盒 (經(jīng)典法)

英文:Venor®Gem qEP    

貨號(hào):11-9025    

品牌:Minerva Biolabs®    

規(guī)格:25次/盒    

特點(diǎn):遵循歐洲藥典和日本藥典檢查的流程,通過方法學(xué)驗(yàn)證;靈敏度高;特異性強(qiáng),操作便捷。



產(chǎn)品用途


德國Minerva Biolabs公司的Venor® GeM qEP kit,用于定量檢測細(xì)胞培養(yǎng)物,及其他生物基質(zhì)中的柔膜體綱微生物,如支原體、無膽甾原體、螺原體。

作用原理


通過擴(kuò)增16S rRNA編碼區(qū)特異性檢測支原體,而真核生物和其他細(xì)菌DNA不能通過Venor®GeM qEP Kit擴(kuò)增。


試劑盒包含所有必要的PCR組分,內(nèi)控DNA可用于鑒定PCR抑制,或DNA抽提問題帶來的假陰性。內(nèi)控DNA可直接加到PCR預(yù)混液里,或加到DNA抽提之前的樣本中。它可用于驗(yàn)證DNA抽提和qPCR擴(kuò)增過程。它可從Minerva廠家購買(貨號(hào)11-9905)。內(nèi)控對照的擴(kuò)增結(jié)果在560nm檢測(HEX通道),而支原體的擴(kuò)增在520nm檢測(FAM通道)。

試劑盒包括dUTP,它替代dTTP,方便用尿嘧啶DNA糖基酶(UNG)監(jiān)視假陽性。該試劑盒不包含UNG。


實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備


一、細(xì)胞培養(yǎng)篩查

細(xì)胞應(yīng)長滿90%以上。細(xì)胞上清可直接用于支原體檢查,無需再樣品制備。但上清中可能累積抑制PCR的物質(zhì),此時(shí)有必要進(jìn)行DNA抽提。未有證據(jù)表明,細(xì)胞培養(yǎng)基中的青鏈霉素存在抑制支原體或影響檢測的靈敏度的情況。

細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體數(shù)量平均為1×10^6/ml,至多為1×10^8/ml,足以滿足PCR的檢測要求。PCR的模板制備如下:

1.轉(zhuǎn)移500μl細(xì)胞培養(yǎng)上清至1.5ml EP管,蓋緊蓋。

2.樣本孵育95℃10分鐘。

3.樣本最大轉(zhuǎn)速離心(15s)以沉淀細(xì)胞碎片。

4.取2μl直接用于qPCR,或樣品儲(chǔ)存在4℃,最多6天。長期保存在-20℃。


二、符合藥典的樣品檢查

1、濃縮樣品(可選步驟)

樣品基質(zhì)可能對檢測方法的靈敏度有至關(guān)重要的影響。進(jìn)一步提高檢測靈敏度的一種方法是收集和篩選比支原體DNA提取所需的更大樣本量的細(xì)胞培養(yǎng)上清(例如,Venor®GeM樣品制備試劑盒>200 μl),并執(zhí)行樣品濃縮步驟。

①轉(zhuǎn)移≤1ml樣品上清至1.5ml離心管。

②離心≥10000 × g 15分鐘(或≥13000× g  6分鐘),以沉淀支原體顆粒。

③棄掉上清,用200ml Tris緩沖液(10mM Tris-HCl,pH8.4)重懸沉淀。

④樣本渦旋混勻,然后直接進(jìn)行樣本穩(wěn)定化處理或DNA抽提。


2.樣品穩(wěn)定化

細(xì)胞培養(yǎng)樣品可能含有高濃度的DNA酶,即使在較低的溫度下也會(huì)降解支原體DNA。因此,我們建議采取以下步驟來穩(wěn)定樣品。如果在樣品采集后立即進(jìn)行DNA提取,則不需要此步驟。請注意,在樣品濃縮步驟之前,不能通過熱失活來穩(wěn)定樣品。

①轉(zhuǎn)移500ml細(xì)胞培養(yǎng)上清至1.5ml離心管。蓋上管蓋。

②95℃孵育10分鐘。

③最大速度進(jìn)行樣本離心(15秒),以沉淀細(xì)胞碎片。

④樣本即可用于DNA抽提,或儲(chǔ)存在4℃,最多6天。長期保存在-18℃以下。


3.DNA 抽提

大量證據(jù)表明,DNA抽提可實(shí)現(xiàn)最高的靈敏度。DNA抽提有多種方法,但應(yīng)適合支原體基因組。我們推薦:

Venor®GeM Sample Preparation kits (貨號(hào)56-1010/-1050/-1200) 適合手動(dòng)DNA抽提。

這些DNA抽提試劑盒已經(jīng)過大量驗(yàn)證,具體流程參見試劑盒說明書。


注意事項(xiàng)

??由于細(xì)胞團(tuán)塊對PCR反應(yīng)的負(fù)面影響,不能直接使用細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行檢測。因此,細(xì)胞團(tuán)塊,或其他生物材料,如疫苗、冷凍儲(chǔ)存和石蠟包埋的樣品,需要在PCR前提取DNA。

已知樣品中胎牛血清(FCS)含量(> 5%)會(huì)增加PCR抑制的可能性。為了避免假陰性結(jié)果,這些樣品可能需要在PCR之前,也需要進(jìn)行DNA提取。

Venor®GeM qEP試劑盒與Venor®GeM樣品制備試劑盒(Cat:No. 56-1010/-1050/-1200)用于支原體DNA提取

??樣品濃縮步驟只適用于完整的支原體細(xì)胞。因此,應(yīng)避免在樣品濃縮之前進(jìn)行“樣品穩(wěn)定",即不能再濃縮前進(jìn)行任何破壞細(xì)胞的程序(如熱失活),請參見“2.樣品穩(wěn)定化"??芍苯犹幚眢w積為200 μl的樣品,無需濃縮步驟。


??Venor®GeM qEP kit包含的內(nèi)控DNA對照,也用于驗(yàn)證DNA抽提步驟。


??樣本濃縮時(shí)不要加內(nèi)控DNA。


??內(nèi)控DNA可單獨(dú)購買(貨號(hào)11-9905)。


??PCR抑制可能因樣本基質(zhì)或者洗脫液產(chǎn)生。因而我們推薦Venor®GeM Sample Preparation kit用于DNA制備,其他品牌試劑盒需要經(jīng)過試驗(yàn)以保證合格。



老张和老李互相换女H| 国产精品毛片VA一区二区三区| 教官脔到她哭H粗话H好爽视频| 亚洲成A人V欧美综合天堂麻豆| 色国产精品一区在线观看| 亚洲AV无码一区二区一二区| 18处破外女出血视频在线观看| 国产亚洲精品无码AA在线观看| 国产A级毛片久久久久久精品| 国产精品久久一区二区三区| XX性欧美肥妇精品久久久久久| 久久久久久久久久| 成人做爰69片免费看网站| 亚洲AV综合色区无码一二三区| 品酒要在成为夫妻后| 国产97色在线 | 日韩| 欧美性大战久久久久久久| 亚洲熟妇AV一区二区三区| 我的漂亮女房东韩剧完整版| 日本VA欧美VA欧美VA精品| 挺进老妇的肉泬M48WXORG| 99精品视频在线观看免费| 亚洲一线产区和二线产区区别| jzzijzzij日本成熟少妇| 无码人妻丰满熟妇区五十路百度| 少妇激情一区二区三区视频| 日欧一片内射VA在线影院| 欧美精品九九99久久在免费线| 精品久久久久久久无码久中文字幕| 久久人做人爽一区二区三区| JAPANESE极品丰满少妇| 女人做爰全过程免费观看美女| 三妻四妾免费观看完整版高清| 国产精品久久久久久麻豆一区| 免费观看片的APP下载| 成人动漫在线| 少妇被又大又粗又爽毛片欧美| 无码国产精品一区二区高潮| 亚洲精品无码久久久久久| 变态另类重口特级| 被猛男CAO烂的小男生GV|